Spektrofotometr jest jednym z instrumentów naukowych powszechnie spotykanych w wielu laboratoriach badawczych i przemysłowych. Spektrofotometry są wykorzystywane do badań w laboratoriach fizyki, biologii molekularnej, chemii i biochemii. Zazwyczaj nazwa odnosi się do spektroskopii w zakresie promieniowania ultrafioletowego (UV-Vis).
Energia światła zależy od jego długości fali, zwykle określanej jako lambda. Chociaż widmo elektromagnetyczne rozciąga się na ogromny zakres długości fal, większość laboratoriów może zmierzyć tylko niewielką ich część. Spektroskopia UV-Vis mierzy od 200 do 400 nanometrów (nm) do pomiarów światła UV i do około 750 nm w widmie widzialnym.
W przypadku spektroskopii UV-Vis próbki są zwykle przechowywane i mierzone w małych pojemnikach zwanych kuwetami. Mogą być z tworzywa sztucznego, jeśli są stosowane w widmie widzialnym, ale muszą być wykonane z kwarcu lub stopionej krzemionki, jeśli są używane do pomiarów UV. Istnieje kilka maszyn, które mogą wykorzystywać szklane probówki.
Spektroskopia widzialna jest często stosowana przemysłowo do kolorymetrii. Za pomocą tej metody próbki mierzy się przy wielu długościach fal od 400 do 700 nm, a ich profile absorbancji porównuje się ze standardem. Technikę tę często stosują producenci tekstyliów i tuszów. Inni komercyjni użytkownicy spektroskopii UV-Vis to laboratoria kryminalistyczne i drukarki.
W badaniach biologicznych i chemicznych rozwiązania często określa się ilościowo, mierząc ich stopień pochłaniania światła przy określonej długości fali. Wartość zwana współczynnikiem ekstynkcji służy do obliczenia stężenia związku. Na przykład laboratoria biologii molekularnej wykorzystują spektrofotometry do pomiaru stężeń próbek DNA lub RNA. Czasami mają zaawansowaną maszynę zwaną spektrofotometrem NanoDrop ™, która wykorzystuje ułamek ilości próbki w porównaniu do tej używanej przez tradycyjne spektrofotometry.
Aby kwantyfikacja była ważna, próbka musi być zgodna z prawem Beer-Lambert. Wymaga to, aby absorbancja była wprost proporcjonalna do długości ścieżki kuwety i absorpcji związku. Dostępne są tabele współczynników ekstynkcji dla wielu, ale nie wszystkich związków.
Wiele reakcji chemicznych i enzymatycznych zmienia kolor w czasie, a spektrofotometry są bardzo przydatne do pomiaru tych zmian. Na przykład enzymy oksydazy polifenolowej, które powodują brązowienie owoców, utleniają roztwory związków fenolowych, zmieniając przejrzyste roztwory na te, które są wyraźnie zabarwione. Takie reakcje można badać przez pomiar wzrostu absorbancji wraz ze zmianą koloru. W idealnym przypadku tempo zmian będzie liniowe i można obliczyć stawki na podstawie tych danych. Bardziej zaawansowany spektrofotometr będzie posiadał kontrolowany temperaturowo uchwyt kuwety do przeprowadzania reakcji w precyzyjnej temperaturze idealnej dla enzymu.
Laboratoria mikrobiologiczne i biologii molekularnej często używają spektrofotometru do pomiaru wzrostu kultur bakterii. Eksperymenty z klonowaniem DNA są często przeprowadzane na bakteriach, a naukowcy muszą zmierzyć etap wzrostu kultury, aby wiedzieć, kiedy przeprowadzić określone procedury. Mierzą absorbancję, zwaną gęstością optyczną (OD), na spektrofotometrze. Z OD można stwierdzić, czy bakterie aktywnie dzielą się, czy zaczynają umierać.
Spektrofotometry wykorzystują źródło światła, aby oświetlać szereg długości fal przez monochromator. To urządzenie przesyła następnie wąskie pasmo światła, a spektrofotometr porównuje natężenie światła przechodzącego przez próbkę z natężeniem przechodzącym przez związek odniesienia. Na przykład, jeśli związek zostanie rozpuszczony w etanolu, odniesieniem będzie etanol. Wynik jest wyświetlany jako stopień absorbancji różnicy między nimi. Wskazuje to na absorbancję próbki związku.
Powodem tej absorbancji jest to, że zarówno ultrafiolet, jak i światło widzialne mają wystarczającą energię, aby wzbudzić chemikalia do wyższych poziomów energii. Wzbudzenie to powoduje zwiększenie długości fali, co jest widoczne, gdy absorbancja jest wykreślana w funkcji długości fali. Różne cząsteczki lub związki nieorganiczne pochłaniają energię przy różnych długościach fal. Osoby o maksymalnej absorpcji w zakresie widzialnym są postrzegane jako barwione przez ludzkie oko.
Roztwory związków mogą być klarowne, ale absorbują w zakresie UV. Takie związki zwykle mają podwójne wiązania lub pierścienie aromatyczne. Czasami występuje jeden lub więcej wykrywalnych pików, gdy wykreślany jest stopień absorpcji względem długości fali. Jeśli tak, może to pomóc w identyfikacji niektórych związków poprzez porównanie kształtu wykresu z kształtem znanych wykresów referencyjnych.
Istnieją dwa rodzaje spektrofotometrów UV-Vis, jedno- i dwuwiązkowe. Różnią się one sposobem pomiaru natężenia światła między próbką odniesienia a badaną. Maszyny dwuwiązkowe mierzą jednocześnie związek odniesienia i badany, natomiast maszyny jednowiązkowe mierzą przed i po dodaniu badanego związku.